Utveckling och användning av FRET-prober - Avslöja ny, unik struktur- och dynamikinformation om nukleinsyrasystem

Kroppen, våra organ och cellerna som bygger upp dessa är begrepp som vi alla relaterar till dagligen. Ökad förståelse härom ändrar inte bara synen på oss själva och hur vi i vardagen bör ta hand om oss och vår omgivning för att kunna leva väl, utan kan även bidra till att bota, förhindra eller förutse sjukdomar. Då våra celler består av molekyler såsom DNA, RNA, proteiner, lipider, så krävs, för att möjliggöra kunskapsutveckling inom området, en ökad fundamental förståelse för molekylär struktur, inneboende dynamik och mekanismer med vilka de växelverkar med andra molekyler. Den 3D-struktur som nukleinsyrorna, DNA och RNA, har och deras dynamik avspeglar sig i den funktion de får i levande organismer. Metoder som röntgenkristallografi och NMR har här spelat och spelar en viktig roll för att få fram detaljerad information. Metoderna är utan tvekan ovärderliga, men har även sina brister såsom behovet av kristaller för kristallografi och komplexiteten, stora provmängder samt begränsade strukturstorleken för NMR. Av tekniker med lägre spatiell upplösning såsom ljusspridningsmetoder, kryoelektronmikroskopi och FRET (förster resonansenergiöverföring) har den senare fördelen att den är billig, lättillgänglig, snabb, kan användas på stora biomolekyler och kräver små provmängder (ner till enmolekylskala). Dessa tekniker komplementerar de två ovan och FRET är den mest använda i struktursammanhang och ger i vissa fall möjlighet att mäta egenskaper som annars är ouppnåeliga. I nukleinsyrasammanhang har FRET-studier länge dominerats av fluorescenta molekyler, fluoroforer, fästa externt på DNAt/RNAt. Dessa fluoroforer, t.ex. Cy-dyes och rhodaminer, är kraftfulla. Däremot har de generellt egenskaper som minskar maximalt möjliga upplösningen då deras spektrala egenskaper varierar med den närmiljö de upplever samt då de fästs flexibelt på DNAt/RNAt och därför inte har en väldefinerad position och orientering relativt DNAt/RNAt under FRET-energiöverföringensprocessen. Sådana begränsningar i kombination med att fluoroforerna ibland signifikant stör nukleinsyrans naturliga egenskaper har oftast begränsat studierna till kvalitativa snarare än kvantitativa. Nyligen introducerade min grupp unika FRET-fluoroforer som består av modifierade DNA-baser, tCO och tCnitro, som parar väl med guanin och därför sitter stabilt positionerade inne i DNA-helixen och således bevarar dess egenskaper. Vidare har de stabila spektrala egenskaper och vi har visat att man tack vare kombinationen av dessa egenskaper både kan få detaljerad avstånds- och vinkelinformation för strukturen. FRET-paret har sedan det introducerats, tillsammans med mitt publicerade freeware för tolkning av data, framgångsrikt använts för flera studier. En begränsing med mitt FRET-par och även generellt för FRET är att längsta möjliga avstånd som kan monitoreras är ca 50-60 Å resp. 80-90 Å. Vidare saknas FRET-par av den natur jag introducerat som klarar fluorescensbaserade enmolekylförsök. Att kunna följa större avstånd samt studera detaljerade struktur- och dynamikförändringar på enstaka molekyler med hjälp av FRET-prober som på ett naturtroget sätt introduceras i DNAt/RNAt vore en stort steg framåt för biokemiska/biofysikaliska studier. Mitt projekt syftar därför till att ta fram nya basanalogbaserade FRET-par för enmolekylmätningar som klarar stark belysning, är ljusstarka och som även klarar att monitorera längre avstånd. Som alternativ metod kommer även metallnanostrukturer användas med mitt befintliga FRET-par för att öka avstånden som är möjliga att studera. Design av nya basanloger sker m.h.a. kvantkemiska beräkningar och syntetiserade molekyler kommer kartläggas spektroskopiskt, fotofysikaliskt och biofysikaliskt för deras egenskaper som basanaloger i DNA/RNA. Jag kommer även göra en omfattande insats där mina fluorescenta basanaloger används i studier av essentiella biomolekyler och deras samverkan. Här kan nämnas a) detaljerade mätningar av konformationsändringar av RNA/DNA-hybriden under transkriptionen (´informationsöverföringen´) från DNA till RNA b) studier över hur stora basanaloger påverkar effektivitet samt stringens vid DNA-polymerasers kopiering av DNA, c) struktur- och dynamikstudier vid DNA-inbindning av rekombinations- och transkriptionsproteinet IHF och d) struktur- och dynamikförändringar av DNA påverkat av olika stora krafter vid enmolekylsförsök. Fundamental molekylär förståelse från alla dessa delprojekt ger essentiell kunskap om livets processer.

Startdatum 2014-01-01
Slutdatum Projektet är avslutat: 2017-12-31

Publicerad: to 31 maj 2018.