Amyloidbildning av Parkinsonsproteinet i cell-liknande miljö

Projektförslag för kandidatarbete inom inst. Kemi och kemiteknik och Biologi och bioteknik
 
​Projektexamenskod: BBTX01-21-02 

Avdelningen för Kemisk Biologi
Institutionen för Biologi och Bioteknik, Chalmers tekniska högskola 


Bakgrund 
Alfasynuklein är en huvudkomponent i amyloida aggregat som återfinns i så-kallade Lewykroppar, vilka är patologiska kännetecknen för Parkinsons sjukdom, den näst vanligaste neurodegenerativa sjukdomen. Alfasynuklein är ett ostrukturerat protein med molekylvikt 14 kDa som finns i hjärnceller, men också i andra celler i kroppen. Alfasynuklein antar en alfa-helixstuktur när det binder till lipidmembran, vilket tros vara del av proteinets normala funktion,  men när det aggregerar till amyloida fibrer antar det en beta-flakstruktur som är typisk för alla amyloida fibrer. Ett antal mutationer har identifierats av proteinet (A30P, E46K, H50Q, G51D, A53T) vilka har kopplats till den ärftliga formen av Parkinsons sjukdom. Provrörsexperiment med framrenat protein har visat att dessa mutationer påverkar aggregationshastigheten hos proteinet. Provrörsexperiment utförs vanligtvis i utspädda buffertlösningar, vilka är annorlunda från förhållandena inuti en cell. Den intracellulära miljön är trång, med en uppskattad mängd på 80–400 mg makromolekyler (proteiner, lipider, polysackarider etc.) per ml, vilket motsvarar exkluderad volym runt 5-40%. Cellmiljön gör att volym är exkluderad steriskt, samt att den ökar viskositeten (trögheten) och det finns också ökade möjligheter för ospecifika interaktioner mellan molekyler. Genom att studera proteinaggregation i cell-liknande miljöer (skapade i provrör) kan vi lära oss om  amyloidbildning i den naturliga miljön.

Problembeskrivning 
I detta projekt är syftet att studera aggregationsprocessen av alfasynuklein och dess patologiska variant, Ala30Pro, i närvaron av så-kallade ’crowding agents’ vilka imiterar den trånga intracellulära miljön genom att ta upp mycket plats. Sockerpolymeren dextran i olika molekylmassor kommer att användas som crowding agent eftersom den visats vara en molekyl som har hög löslighet och inte interagerar med proteiner. Frågan att besvara är hur crowding agenten påverkar aggregeringshastighet och slutprodukt (amyloida fibrer), som funktion av crowding agentens storlek och mängd.
 
Genomförande /Viktiga moment/teknikinnehåll 
1.  Uttryck av mänsklig alfasynuklein I E. coli bakterier. Rening av proteiner genom användning av jonbyteskromatografi och gelfiltrering.

2.  Strukturella studier av det renade proteinerna (monomerer) genom användning av cirkulär dikroism spektroskopi, med och utan crowding agents.

3.  Aggregationskinetik av proteinvarianterna följs genom Tioflavin-T fluorescens som rapporterar om amyloidbildning som funktion av tiden i närvaro av crowding agents. Här studeras både vanliga aggregering från monomerer, samt reaktioner där aggregering påskyndas genom att en liten mängd amyloida fibrer tillsätts vid tidpunkt noll (som en katalysator).  

4.  Karaktärisering av de bildade fibrillaggregatens morfologi och storlek genom användning av atomkraftsmikroskopi

Speciella förkunskapskrav: Grundläggande laborationsvana, teoretisk kännedom av proteinstruktur och funktion. Grundläggande förståelse för spektroskopiska tekniken: UV-Vis, CD, fluorescens. Tidigare erfarenhet av rekombinations proteinuttryck och rening är en fördel.

Möjlig målgrupp Kopplat till förkunskaper, lämpliga program som K, Kf och Bt.

Gruppstorlek: 4–6 studenter (varav 3 platser är vikta för förslagsställarna)

Förslagsställare: Monica Pernsved, Elin Persson, Nikita Rhenberg
Kontaktperson/huvudhandledare: ​​Pernilla Wittung-Stafshede
Övriga handledare: Istvan Horvath, Ranjeet Kumar

Sidansvarig Publicerad: fr 30 okt 2020.